癌癥疫苗通過激活細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）來攻擊腫瘤細胞，但其效果常因免疫原性不足、抗原呈遞效率低以及腫瘤微環(huán)境（TME）的免疫抑制特性而受限。為克服這些挑戰(zhàn)，作者開發(fā)了一種病毒模擬納米疫苗（cGAMP@vEVs），通過工程化腫瘤細胞來源的細胞外囊泡（tEVs），使其表達病毒相關(guān)蛋白（VSVG和CRT），并加載STING通路激活劑cGAMP，以增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。

cGAMP@vEVs通過VSV感染腫瘤細胞制備，加載cGAMP后展現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。體外實驗表明，cGAMP@vEVs能夠被同源腫瘤細胞和樹突狀細胞（DCs）高效攝取，顯著激活STING通路，促進IFN-β產(chǎn)生，增強DCs成熟和T細胞激活。體內(nèi)實驗表明cGAMP@vEVs在腫瘤和淋巴結(jié)中高效積累，顯著增加腫瘤內(nèi)CD4⁺和CD8⁺ T細胞比例，降低調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）比例，增強腫瘤特異性CD8⁺ T細胞浸潤。此外，cGAMP@vEVs顯著抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，延長小鼠生存期，且未引起明顯的肝腎功能損傷或病理組織變化。

綜上，cGAMP@vEVs作為一種新型納米疫苗，通過工程化細胞外囊泡實現(xiàn)了高效抗原遞送和免疫激活，為癌癥免疫治療提供了新思路。

基本信息

題目：Engineered virus-mimicking nanovaccine with lymph node–tumor dual-targeting and STING-activating capacity for robust cancer immunotherapy

期刊：Journal of Controlled Release

影響因子：10.5

PMID：39694072

通訊作者：黃利利^a 梅林^c 呂桂紅^b 張帆^c

作者單位：a北京理工大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院；b深圳市兒童醫(yī)院兒童保育與心理健康中心；c中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所

索萊寶合作產(chǎn)品：

摘要

癌癥疫苗在腫瘤免疫治療領(lǐng)域備受關(guān)注，但其療效受限于細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的增殖不足、活化不足及腫瘤浸潤困難。受病毒成分的強免疫刺激特性及病毒感染誘導(dǎo)的免疫原性細胞死亡（ICD）中鈣網(wǎng)蛋白暴露的啟發(fā)，該研究開發(fā)了一種仿病毒納米疫苗策略cGAMP@vEVs：通過病毒感染工程化腫瘤細胞來源的胞外囊泡，使其共同負載個性化/廣譜抗原庫及多種免疫佐劑，以高效激發(fā)抗腫瘤免疫。實驗表明cGAMP@vEVs兼具優(yōu)異的淋巴結(jié)-腫瘤雙靶向能力和STING通路激活能力，可驅(qū)動淋巴結(jié)內(nèi)腫瘤特異性CD8⁺ T細胞的增殖與活化；同時主動富集于腫瘤部位，改善免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（TME），促進CTL的自發(fā)浸潤。這種免疫響應(yīng)與TME重塑的協(xié)同作用重啟了癌癥免疫的自循環(huán)，從而有效抑制腫瘤進展、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。

研究內(nèi)容及結(jié)果

01

cGAMP@vEVs的制備及表征

Western blot驗證了vEVs中存在VSVG和CRT，而tEVs中不存在，盡管兩者都表現(xiàn)出高水平的代表性CD63和ALIX蛋白，以及與腫瘤自身識別相關(guān)的CD324和CD47蛋白，還有4T1細胞的自身標(biāo)記物CD44。vEVs的產(chǎn)量大約是tEVs的1.6倍，表明VSV感染促進了細胞外囊泡從其親本細胞的產(chǎn)生。通過電穿孔將STING激動劑cGAMP加載到vEVs中，當(dāng)vEVs與cGAMP的質(zhì)量比為1:4時，加載達到飽和，最大加載效率約為14%。cGAMP@vEVs的尺寸在cGAMP加載后從100.04±1.70穩(wěn)定增加到138.69±4.84。如圖1g所示，cGAMP和VSVG在cGAMP@vEVs中很好地共定位（共定位效率：91.4%）。

圖1

02

cGAMP@vEVs被腫瘤細胞

和樹突狀細胞的靶向攝取

如圖2a所示，與其他細胞系相比，同型4T1細胞在2小時孵育后顯示出更多的cGAMP@vEVs（用4T1細胞的vEVs加載cGAMP）。定量分析表明cGAMP@vEVs處理的4T1細胞的平均熒光強度（MFI）大約是cGAMP@vEVs處理的HepG2（人肝細胞癌）、B16（小鼠黑色素瘤）、CT26（小鼠結(jié)腸癌）或HC11（小鼠正常乳腺）細胞的3-10倍。如圖2c所示，與cGAMP@tEVs相比BMDCs顯示出更多的cGAMP@vEVs。cGAMP@vEVs陽性BMDCs的百分比大約是cGAMP@tEVs陽性BMDCs的1.38倍，表明vEVs上的CRT顯著增強了BMDCs對cGAMP的攝取效率。

圖2

03

STING通路激活與

腫瘤相關(guān)抗原交叉呈遞

共聚焦成像和共定位效率分析表明大多數(shù)tEV遞送的Cy5-cGAMP在與BMDCs共孵育6小時后與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體共定位，而大多數(shù)vEV遞送的Cy5-cGAMP分散在細胞質(zhì)中。與單獨用cGAMP或cGAMP@tEVs處理的BMDCs相比，用cGAMP@vEVs處理的BMDCs顯示出顯著增強的磷酸化IRF3和TBK1的表達。與cGAMP或cGAMP@tEV處理的BMDCs相比cGAMP@vEVs處理的BMDCs產(chǎn)生了高水平的IFN-β（51.51±3.12 pg/mL），而cGAMP或cGAMP@tEV處理的BMDCs僅誘導(dǎo)了低或中等水平的IFN-β（分別為24.14±1.05和35.70±1.60 pg/mL）。此外，cGAMP@vEV處理導(dǎo)致同源腫瘤細胞中磷酸化IRF3和TBK1的表達增強。

如圖3k-n所示，與cGAMP處理的BMDCs相比，cGAMP@vEVs處理的BMDCs中MHC-I和CD80CD86的表達水平顯著上調(diào)，分別為1.94倍和1.62倍；與cGAMP@tEVs處理的BMDCs相比，分別為1.23倍和1.29倍，表明DC成熟。此外，cGAMP@vEVs誘導(dǎo)BMDCs產(chǎn)生高水平的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）。在cGAMP@vEVs處理后觀察到CD3⁺ CD8⁺ T細胞群中CD69⁺ T細胞的百分比增加，伴隨著IFN-γ和顆粒酶B的產(chǎn)生增加，表明T細胞激活效率高。

圖3

04

體內(nèi)腫瘤-淋巴結(jié)雙靶向與免疫激活

DiR信號逐漸在腫瘤和LNs中積累，并在注射后48小時達到峰值；然而在正常組織中幾乎檢測不到。DiR標(biāo)記的cGAMP@vEVs的峰值強度在腫瘤中與DiR標(biāo)記的tEVs相當(dāng)，而在LNs中大約是后者的兩倍。大量cGAMP@vEVs在LNs中積累并與DCs共定位，證實cGAMP@vEVs能夠有效地遷移到LNs并與DCs在體內(nèi)特異性相互作用。

此外，與cGAMP@tEVs處理的小鼠相比cGAMP@vEVs處理的小鼠的LNs中包含更多的免疫細胞，這些共定位的DCs與CD4⁺和CD8⁺ T細胞高度共定位（共定位效率分別為99.6%和98.9%），表明潛在的T細胞激活。cGAMP@vEVs處理的小鼠的腹股溝LNs中DCs的CD80 CD86和MHC-II的表達水平最高，從12.1%和12.3%分別增加到40%和37.2%。與單獨用cGAMP或cGAMP@tEVs處理的小鼠相比，cGAMP@vEVs處理的小鼠中DCs的MHC-I表達水平分別增加了1.59倍和1.14倍。此外，cGAMP@vEVs處理導(dǎo)致引流LNs中CD11c⁺SIINFEKL-H-2Kb⁺抗原交叉呈遞DCs的最大水平。

圖4

05

腫瘤微環(huán)境調(diào)控與腫瘤進展抑制

與調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs，CD25⁺Foxp3⁺）相比，CD4⁺（CD4⁺CD3⁺）和CD8⁺（CD8⁺CD3⁺）T細胞的百分比顯著增加。cGAMP@vEVs注射導(dǎo)致腫瘤內(nèi)CD8⁺和CD4⁺ T細胞與Tregs的比例分別增加了8.69倍和14.4倍。此外，cGAMP@vEV處理顯著增加了腫瘤內(nèi)CTLs（CD3⁺CD8⁺IFNγ⁺）的豐度。如圖5h所示，與PBS組相比，用vEVs處理的腫瘤顯示出許多免疫激活相關(guān)基因的上調(diào)表達，如CXCL10、CD40和TLR9，以及免疫抑制基因的下調(diào)表達，如MMP10和VEGFA。癌癥促進因子如TGFB2和ARG1也被下調(diào)。

與PBS組相比，vEV處理組的細胞因子-細胞因子受體相互作用、Toll樣受體信號通路和趨化因子信號通路顯著激活。與單獨用cGAMP、cGAMP ⁺ vEVs或cGAMP@tEVs處理的組相比，cGAMP@vEVs組顯示出更明顯的腫瘤生長抑制。此外，其他組的小鼠在45天內(nèi)死亡；然而，>83%的cGAMP@vEVs組小鼠存活。

圖5

06

抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)

如圖6b所示，在用PBS、tEVs、vEVs、cGAMP或cGAMP@tEVs處理的小鼠中觀察到明顯的肺轉(zhuǎn)移，而在用cGAMP@vEV處理的組中幾乎未觀察到轉(zhuǎn)移。此外，cGAMP@vEV處理組的肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量和肺重量顯著減少（圖6c-d），突顯了cGAMP@vEVs在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面的顯著優(yōu)勢。

cGAMP@vEVs處理組顯示出顯著的腫瘤生長抑制和更長的存活時間，腫瘤抑制率為50.6%（圖6f-h）。定量分析顯示，cGAMP@vEVs處理組小鼠脾臟中腫瘤特異性CD8⁺ T細胞的百分比顯著增加（圖6i）。此外，與PBS對照組相比，cGAMP@vEVs處理組小鼠脾臟中的效應(yīng)記憶T細胞（TEM）（CD3⁺CD8⁺CD62L-CD44⁺細胞）增加了27.9%（圖6j-k）。

圖6

結(jié)論

該研究創(chuàng)新性地利用水皰性口炎病毒（VSV）感染的工程化腫瘤細胞來源的胞外囊泡（vEVs），構(gòu)建了一種仿病毒納米疫苗cGAMP@vEVs。該疫苗通過VSV-G糖蛋白和鈣網(wǎng)蛋白（CRT）的協(xié)同作用，實現(xiàn)了淋巴結(jié)與腫瘤組織的雙重靶向：一方面激活淋巴結(jié)中的STING通路以促進T細胞活化與增殖，另一方面直接作用于腫瘤微環(huán)境以逆轉(zhuǎn)免疫抑制狀態(tài)。與傳統(tǒng)疫苗相比，該策略突破性地實現(xiàn)了多腫瘤抗原與佐劑cGAMP的共遞送，克服了單一抗原免疫原性不足的缺陷，在顯著提升疫苗生物利用度的同時確保了良好的安全性特征。

從臨床轉(zhuǎn)化角度來看，該技術(shù)方案具有顯著的實用優(yōu)勢?？煽焖僦苽鋫€性化疫苗，其工藝流程相較于新抗原疫苗或過繼性細胞治療更為簡便可靠，為腫瘤免疫治療的臨床推廣提供了新的技術(shù)路徑。然而，要實現(xiàn)該療法的臨床應(yīng)用，仍需通過大型動物實驗驗證其規(guī)?；苽涞姆€(wěn)定性，在患者來源異種移植（PDX）模型中系統(tǒng)評估其治療效能，并建立規(guī)范的長期安全性評價體系。

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