免疫細(xì)胞的分離和保存技術(shù)

一、分離細(xì)胞的保存

在某些情況下，分離所得細(xì)胞需要加以保存，否則活力迅速下降，甚死亡。

（一）短期保存技術(shù)

       將分離到的細(xì)胞用適量含10％～20％滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養(yǎng)液稀釋重懸。所用培養(yǎng)液要求等滲，具緩沖作用，并對細(xì)胞無毒性。通常置4℃保存較好，可減低細(xì)胞代謝活動。要注意不要迅速改變細(xì)胞所處的溫度，以免造成細(xì)胞“溫度”休克。

（二）長期冷凍保存技術(shù)

       利用液氮深低溫（－196℃）環(huán)境保存細(xì)胞，是當(dāng)前世界上通用的細(xì)胞長期保存技術(shù)。其原理在于深低溫環(huán)境可中斷細(xì)胞的代謝，但在降溫過程由于冰晶的形成和滲透壓的改變均可導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和部分死亡，所以在冷凍過程中一定要加用冷凍保護(hù)劑，常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）。冷凍時(shí)的降溫速度和細(xì)胞解凍時(shí)的升溫速度對細(xì)胞活力的保存有很大影響。條件合適時(shí)，凍存細(xì)胞一旦復(fù)蘇，恢復(fù)37℃培養(yǎng)，其形態(tài)和代謝活動均可恢復(fù)正常。操作的原則是先對需凍存的細(xì)胞作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，低速離心后，取沉積細(xì)胞用含10％二甲亞砜的小牛血清配制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管內(nèi)，速即放入降溫過渡站中，避免二甲亞砜對細(xì)胞的損傷。繼而進(jìn)行降溫冷凍

       目前常用兩步降溫法，即迅速降溫一選擇好的臨界溫作為過渡站，如－80℃低溫冰箱，或在液氮罐液面以上的一層空間放置片刻，然后再放入液氮中。如需復(fù)蘇細(xì)胞，則需迅速解凍以恢復(fù)細(xì)胞的活力，要求在20s以內(nèi)*融化。將凍存管自液氮中取出，立即放入40℃溫水中，融化后即從水中取出，吸出細(xì)胞懸液，加入10倍的培養(yǎng)液中混勻，繼而低速離心，盡快洗去保護(hù)劑，再懸于新培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)并檢查細(xì)胞活力，然后置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

二、細(xì)胞活力測定

       細(xì)胞活力常用百分比表示，活力的大小對試驗(yàn)結(jié)果有很大影響。細(xì)胞活力的測定有許多方法，簡便常用的方法是臺盼藍(lán)（trypanblue）染色法。臺盼藍(lán)又稱錐藍(lán)，是一種陰離子型染料，這種染料不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，但死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，可使染料通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞著色呈藍(lán)色。