微生物培養(yǎng)（microculture)是生物培養(yǎng)的中的一種。所培養(yǎng)的微生物主要有病毒、細(xì)菌、放線菌、真菌等。微生物培養(yǎng)需要用到培養(yǎng)基，根據(jù)微生物的不同種類和生活習(xí)性來配制特定的培養(yǎng)基。微生物培養(yǎng)成功的關(guān)鍵在于無菌操作，如果培養(yǎng)器具和培養(yǎng)基不能*滅菌、培養(yǎng)的過程中有雜菌污染是很容易失敗的。那么微生物培養(yǎng)步驟有哪些呢？

實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)步驟

實(shí)驗(yàn)材料

1 培養(yǎng)基和菌種

淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏I號培養(yǎng)基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基，活性污泥混合液。普通瓊脂斜面和平板,營養(yǎng)肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。

2 溶液或試劑

10%酚液，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂。

3 儀器或其它用具

無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環(huán)，無菌培養(yǎng)皿，鏈霉素和土樣，顯微鏡，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、涂布器等。酒精燈，玻璃鉛筆，火柴，試管架、接種環(huán)、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。

微生物培養(yǎng)步驟

1、流程

倒平板→制備梯度稀釋液→涂布（或劃線法）→培養(yǎng)→挑單菌落→保存。

2、步驟

2.1稀釋涂布平板法

2.1.1 倒平板

將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏I號瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化待冷55～60℃時(shí)，高氏I號瓊脂培養(yǎng)基中加入10%酚數(shù)滴，馬丁氏培養(yǎng)中加入鏈霉素溶液(終濃度為30μg/ml)，混合均勻后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹?，試管或瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。

2.1.2 制備活性污泥混合液稀釋液

稱取土樣l0g，放入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細(xì)胞分散。用一支lml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的活性污泥混合液溶液，注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換一支試管。

2.1.3 涂布

將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號筆寫上10-4、10-5和10-6三種稀度，然后用無菌吸管分別由10-4、10-5和10-6，從三管活性污泥混合液稀釋液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在對應(yīng)平板培養(yǎng)基表面中央位置。用無菌玻璃涂棒，右手拿無菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。室溫下靜置5～l0min，使菌液浸入培養(yǎng)基。

2.1.4 培養(yǎng)

將高氏I號培養(yǎng)基平板和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒置于28℃溫室中培養(yǎng)3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)2～3d。

2.1.5 觀察并挑菌落

將培養(yǎng)后長出的單個(gè)菌落根據(jù)其大小、顏色、形狀等特征進(jìn)行觀察，之后根據(jù)菌落不同特征分別挑取少許細(xì)胞接種到上述三種培養(yǎng)基斜面上，分別置28℃和37℃溫室培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

2.2 平板劃線分離法

2.2.1 倒平板

按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、土樣編號和實(shí)驗(yàn)日期。

2.2.2 劃線

在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10-l的活性污泥混合液懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使之形成單個(gè)菌落。

用接種環(huán)以無菌操作挑取活性污泥混合液懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作*次平行劃線3～4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70度角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過*次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過第二次劃線部分作第三次劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。