土壤淀*酶（S-AL）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC1925

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取1瓶加入5 mL蒸餾水，置于常溫水中并加熱至煮沸，期間不斷攪拌或震蕩至粉劑溶解，用不完的試劑2-8℃保存一周。

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg麥芽糖。臨用前加入1.38 mL蒸餾水配制成20 μmol/mL的儲備液，2-8℃保存兩周。

產(chǎn)品說明：

淀*酶（EC3.2.1.1）是催化淀粉水解的一類酶的總稱。土壤中的淀*酶主要來自于微生物，是一種重要的酶制劑，廣泛應(yīng)用于糧食加工、食品、釀造、發(fā)酵、紡織品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)。

淀*酶水解淀粉產(chǎn)生還原糖，可與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)生成紅棕色物質(zhì)，在540nm處有特征吸收峰，顏色深淺在一定范圍內(nèi)與還原糖量成正比。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

天平、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋、低溫離心機、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、30~50目篩、研缽、甲苯（不允許快遞）。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

新鮮土樣自然風(fēng)干或37℃烘箱風(fēng)干，過30~50目篩。

二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，波長調(diào)至540nm，分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2. 將20μmol/mL的麥芽糖儲備液用蒸餾水稀釋為 2、1、0.8、0.6、0.4μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度稀釋表

備注：實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需60µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4. 操作表：

三、土壤淀*酶活力的計算

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）

2、酶活的計算：

單位的定義：每天每g土樣產(chǎn)生1μmol還原糖定義為一個土壤淀*酶活力。

S-AL（U/g 土樣）= x×V反總÷W÷T=0.21×x÷W

V反總：酶促反應(yīng)總體積，0.21mL；W：土樣質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，1d。

注意事項：

1、 當(dāng)ΔA大于1.5時，建議將上清液稀釋后再進行測定，注意在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2、 若ΔA測定較小，增加反應(yīng)的上清液體積或適當(dāng)增加酶促反應(yīng)時間，計算酶活時對公式進行修改。

3、 建議每次實驗煮沸后的冷卻時間保持一致，吸光值請于30min內(nèi)測定完成。

實驗實例：

1、 取0.05g土樣于1.5mLEP管中，依次加入10μL甲苯、100μL試劑一、100μL試劑二為測定管；取0.05g土樣于1.5mLEP管中，依次加入10μL甲苯、100μL試劑一、100μL蒸餾水為對照管，均放于37℃培養(yǎng)24h，后離心取上清再液稀釋3倍，之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定 =A測定管-A對照管=0.948-0.12=0.828，標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.7604x-0.158，x=1.297，按土樣質(zhì)量計算酶活得：

S-AL（U/g 土樣）=0.21×x÷W×3（稀釋倍數(shù)）=0.21×1.297÷0.05×3（稀釋倍數(shù)）=16.34 U/g 土樣。

參考文獻：

[1] Kathiresan K, Manivannan S. α-Amylase production by Penicillium fellutanum isolated from mangrove rhizosphere soil[J]. African journal of Biotechnology, 2006, 5(10).

[2] Ebregt A, Boldewijn J. Influence of heavy metals in spruce forest soil on amylase activity, CO 2 evolution from starch and soil respiration[J]. Plant and Soil, 1977, 47(1): 137-148.

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