非蛋白質巰基含量檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC1435
規(guī)格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液的配制：將提取液一和提取液二按體積比1：1的比例混合配制，按照樣本數(shù)量配制并在當天用完；

2. 試劑二：臨用前加入2 mL無水甲醇充分溶解備用，4℃可保存八周；

3. 標準品：10 mg半胱*酸，臨用前加入1.65 mL提取液配制成50 µmol/mL的半胱*酸標準溶液備用，2-8℃可保存1個月。

產品說明：
生物體內巰基主要包括非蛋白質巰基和蛋白質巰基。巰基化合物在體內具有重要的解毒功能，對生物體的自我調節(jié)具有非常重要的生理意義。

巰基基團與5,5’-二硫代-雙-硝*酸（DTNB）反應，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰。

技術指標：
低檢出限：0.0061 μmol/mL
線性范圍：0.00625-0.8 μmol/mL
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、恒溫水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、甲醇、研缽/勻漿器、超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 動物、植物組織：稱取約0.1g，加入1mL的提取液，制備成10%的勻漿，10000g，常溫離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細胞或細菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL 提取液），超聲波破碎細胞（功率200w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min），然后10000g，常溫離心10min，取上清置冰上待測。

3. 血清（漿）、培養(yǎng)液等液體樣本：向0.1mL血清（漿）、培養(yǎng)液等液體樣本中加入1mL提取液，10000g，常溫離心10min，取上清置冰上待測。

二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至412nm，分光光度計用蒸餾水調零。

2. 標準品的制備：將50μmol/mL標準溶液用提取液稀釋至0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μmol/mL 的標準液待測，現(xiàn)用現(xiàn)配，具體稀釋可參考下表。

備注：實驗中每個標準管需60µL標準溶液。

1. 操作表

三、計算公式

1. 標準曲線的繪制：

根據(jù)標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據(jù)標準曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/mL）。

1. 非蛋白質巰基含量計算：

1. 按樣本質量計算

非蛋白質巰基含量（µmol/g 質量）=x×V提取÷W=x÷W

1. 按血清、培養(yǎng)液體積計算

非蛋白質巰基含量（µmol/mL）=x×（V提取+V液體）÷V液體=11×x

1. 按細胞數(shù)量計算

非蛋白質巰基含量（μmol/10⁴ cell）=x×V提取÷500=0.002×x
V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；W：樣本質量，g；Cpr，樣本蛋白濃度，mg/mL；500：500萬個細胞；V液體：血清（漿）或培養(yǎng)液體積，0.1mL。

注意事項：
如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。注意同步修改計算公式。
實驗實例：

1. 取0.1g小鼠腎臟加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.457-0.061=0.396，帶入標曲y=2.4988x+0.0666，得出x=0.1318，按樣本質量計算含量得：

非蛋白質巰基含量（µmol/g質量）=x÷W=0.1318÷0.1=1.318µmol/g 質量。
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