AnnexinV Alexa Fluor488/PI凋亡檢測試劑盒

產品簡介：
細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外，使 PS 暴露在細胞膜外表面。PS 是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使 PS 暴露在細胞膜外。Annexin V 具有易于結合到磷脂類如 PS 的特性，對 PS 有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的 PS。PS 轉移到細胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是 完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用Annexin V與PI 雙染的方法，通過流式檢測細胞早期凋亡。

操作步驟:
1、細胞樣品的準備：
a)對于貼壁細胞：小心收集細胞培養(yǎng)液到一離心管內備用。用不含 EDTA 的胰酶消化細胞，細胞可以被輕輕
用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次
收集到離心管內。1000rpm 左右離心 5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法*離心離心管底，
可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50µl 左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。
加入約 1ml 4℃預冷的 PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清；
b)對于懸浮細胞：1000rpm 左右離心 5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法*離心離心
管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50µl 左右的培養(yǎng)液，以避免
吸走細胞。加入約 1ml 4℃ 預冷的 PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清；
2、用去離子水按 1:3 稀釋結合緩沖液(4ml 4x 結合緩沖液+12ml 去離子水)；
3、用 1x 結合緩沖液重新懸浮細胞，調節(jié)其濃度為 1-5×106/ml；
4、取 100µl 的細胞懸液于 5ml 流式管中，加入 5µl Annexin V/Alexa Fluor 488 混勻后于室溫避光孵育 5 分鐘；
5、加入 10µl 20ug/ml 的碘化丙錠溶液(PI)，并加 400µl PBS，立刻進行流式檢測。
實驗設計：
1、空白管：陰性對照組細胞，不加 Annexin V/Alexa Fluor 488，碘化丙錠溶液(PI)。用于調節(jié)電壓；
2、單染管：陽性對照組細胞，只加 Annexin V/Alexa Fluor 488。用于調節(jié)補償；
3、檢測管：處理的細胞，加 Annexin V/Alexa Fluor 488，碘化丙錠溶液(PI)。用空白管和單染管調節(jié)好電壓補償
后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
注意事項：
1、Annexin V 是與磷脂酰絲氨酸(PS)親和，而 PS 在不同種屬間沒差異。在正常細胞中，PS 只分布在細胞膜脂
質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，PS 由脂膜內側翻向外側；
2、低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細胞 2～3 次，離心機 4℃1000rpm 5min 離心，處理得當?shù)脑挘让冈斐蓳p
傷可以控制在 5%以內，有對照組的情況下對實驗結果不會造成明顯影響。
3、先加PI 不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷，而且 PI 本身對細胞也是有毒性的，對實驗結果影響會比胰
酶大，不建議這樣做；
4、Annexin V 是Ca 依賴的蛋白，所以不能加入 EDTA，防止 EDTA 螯合了 Ca 離子從而影響 Annexin V，進而影
響結果。
5、用流式檢測凋亡時，PI 受時間的影響很大，因標記了 PI 后會加大細胞毒性，隨著時間延長會導致 PI 的染
色增加，特別是檢測早期凋亡時，如果時間延長除了會導致在流式細胞儀上的細胞分群差距加大外，誤差會明顯
加大。一般 PI 加上后立刻上機，然后在一個小時內檢測完成。兩種方法都可以，但是按照我們操作步驟造成
的誤差會更小。

相關文獻：

《The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell》 作者:Ruifeng Zhao , Jing Jin , Xinyu Sun , Kai Jin , Man Wang , Mahmoud F. Ahmed , Qisheng Zuo , Yani Zhang ,Zhenhua Zhao , Guohong Chen , Bichun Li 期刊:Journal of cellular Biochemistry 影響因子:3.062 PMID:30076744
《Leukemia inhibitory factor promotes extracellular matrix synthesis in degenerative nucleus pulposus cells via MAPK-ERK1/2 signaling pathway》 作者:Hao Zhou,Jieliang Shen,Zhenming Hua,Xiaoming Zhong 期刊:Biochemical and Biophysical Research Communications 影響因子:2.705 PMID:30446227
 

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