儲存條件
-20℃
莽草酸脫氫酶活性檢測試劑盒微量法
有效期
6個月
單位
盒
推薦
若使用96孔板測定，需使用96孔UV板，推薦貨號YA0602
英文名稱
Shikimic acid Dehydrogenase(SD) Activity Assay Kit
檢測方法
微量法 Spectrophotometer/Microplate Reader
規(guī)格
100T/96S

產(chǎn)品型號：BC4185-100T/96S

更新時間：2024-04-12

廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家

訪問量：886

服務熱線

010-50973130

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產(chǎn)品分類

PRODUCT CLASSIFICATION

生化檢測試劑盒-微量法

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產(chǎn)品介紹

莽草酸脫氫酶（SD）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號: BC4185
規(guī)格: 100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

試劑名稱	規(guī)格	保存條件
提取液	液體100 mL×1瓶	2-8℃保存
試劑一	液體10 mL×1瓶	2-8℃保存
試劑二	粉劑×1瓶	2-8℃保存
試劑三	粉劑×1瓶	-20℃保存

溶液的配制：

提取液：內(nèi)含不溶物，用前搖勻。
試劑二：臨用前加入5 mL蒸餾水溶解。
試劑三：臨用前每瓶加入10 mL蒸餾水溶解。
工作液的配制：根據(jù)用量按照試劑一：試劑二：試劑三為7:4:8的體積比例充分混勻，備用，用前25℃預熱15min。

產(chǎn)品說明：
莽草酸途徑是存在于植物和微生物中的一條重要的代謝途徑，莽草酸脫氫酶(EC 1.1.1.25) 是莽草酸合成代謝途徑中催化第四步反應的關鍵酶。
莽草酸脫氫酶催化莽草酸和NADP產(chǎn)生NADPH，檢測340nm下的吸光值增加速率來表示SD活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液（加入前搖勻））進行冰浴勻漿，然后，8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
2、細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
3、液體：直接檢測。
二、測定步驟

紫外分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，紫外分光光度計蒸餾水調(diào)零。
工作液25℃預熱10min以上。
操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入下列試劑：

試劑名稱	空白管	測定管
工作液（µL）	190	190
樣本（µL）		10
蒸餾水（µL）	10
加入樣本即開始計時，充分混勻后于340nm處測定20s時的吸光值A1和5min20s時的吸光值A2，計算ΔA測定管=A2測定-A1測定，ΔA空白管=A2空白-A1空白，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管（空白管只需做1-2次）。

三、SD酶活計算
A、按微量石英比色皿計算：

按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
SD酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=643×ΔA÷Cpr

按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每克樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
SD酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T=643×ΔA÷W

按細胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細胞每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
SD酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數(shù)量（萬個））÷T
=643×ΔA÷細胞數(shù)量（萬個）

按液體體積計算

酶活定義：每mL液體樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
SD酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷V樣÷T=643×ΔA
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應體系中樣本體積，0.01mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，5min；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；V樣總：加入提取液體積，1mL。
B、按96孔UV板計算：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進行計算即可。

注意事項：

樣本提取上清液置于冰上待測，且樣本提取完成后建議2h內(nèi)測完。
樣本的蛋白濃度需自行測定，由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1 mg/mL），所以測定樣本蛋白濃度時需扣除提取液自身蛋白濃度。
ΔA大于1時，建議將樣本稀釋后再進行測定。當ΔA小于0.01時，可以延長反應時間（10min或15min）來測定。
空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，變化不超過0.01。

實驗實例：

取0.1g稗草，加入1mL提取液，進行樣本處理，取上清按照測得步驟操作，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管=A2測定-A1測定=0.2771-0.2433=0.0338，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.0338，按照樣本質(zhì)量計算得：SD酶活（U/g 質(zhì)量）=643×ΔA÷W=217.334 U/g 質(zhì)量。