過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒說明書（鉬酸銨法）
可見分光光度法
貨號(hào)：BC4780
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取1瓶試劑二加入17.5mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑2-8℃保存一周。

2. 20μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液的配制：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中，使用前需先離心。本試劑盒所提供標(biāo)準(zhǔn)品為1mmol/mL H₂O₂標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用前取0.2mL標(biāo)準(zhǔn)品加入9.8mL試劑一稀釋或者根據(jù)樣本量按照比例配制，充分混勻，即為20μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說明：
CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是最主要的H₂O₂清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。
H₂O₂可與鉬酸銨反應(yīng)形成穩(wěn)定的黃色復(fù)合物，在405nm處有強(qiáng)烈吸收峰，且其吸光值大小與過氧化氫濃度成正比。通過測定反應(yīng)體系中剩余的H₂O₂量，得出被CAT催化分解的H₂O₂量，進(jìn)而反映CAT的活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、恒溫水浴鍋、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣本的制備：
a、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200W，超聲3s，間隔9s，重復(fù)30次）；8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
b、組織：按照組織質(zhì)量(g) : 提取液體積(V)=1 : 5~10（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣本：直接檢測。
二、測定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至405nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 測定前將20μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液與試劑一在25℃水浴10min以上。

3. 加樣表：

• CAT活性計(jì)算

1、血清（漿）CAT活力的計(jì)算：
單位的定義：在25℃條件下，每mL血清（漿）每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(U/mL)=（ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×20×V標(biāo)準(zhǔn)÷V樣÷T×F=10×（ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×F
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中CAT活力計(jì)算：
1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：在25℃條件下，每mg組織蛋白每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(U/mg prot)=（ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×20×V標(biāo)準(zhǔn)÷（Cpr×V樣）÷T×F=10×（ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）÷Cpr×F
2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：
單位的定義：在25℃條件下，每g組織每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(U/g 質(zhì)量)=（ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×20×V標(biāo)準(zhǔn)÷（V樣÷V樣總×W）÷T×F=10×（ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）÷W×F
3） 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：
單位的定義：在25℃條件下，每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(U/10⁴ cell)=（ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×20×V標(biāo)準(zhǔn)÷（V樣÷V樣總×500）÷T×F=0.02×（ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）×F
20：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，20μmol/mL；V標(biāo)準(zhǔn)：加入標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.3mL；V樣：加入樣本體積，0.06mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min；F：樣本稀釋倍數(shù)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。
注意事項(xiàng)：

1. 本試劑盒多給出25mL的提取液，供樣本稀釋使用。

2. 如果反應(yīng)液有大量氣泡產(chǎn)生，將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。

3. 如果樣本量過多，為保證反應(yīng)時(shí)間（25℃，10min）的準(zhǔn)確性，建議分成若干批次檢測，每批次檢測均需配1-2個(gè)空白管與標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 當(dāng)A測定小于0.12或者約等于A對照時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。

5. 動(dòng)物組織如肝臟、腎臟等酶活性較高樣本，預(yù)實(shí)驗(yàn)建議將樣本用提取液多個(gè)高倍稀釋（如25倍、50倍、100倍等）試驗(yàn)后，再進(jìn)行檢測。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g小鼠肝臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清用提取液稀釋400倍后按照測定步驟操作，用玻璃比色皿測得計(jì)算ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.929-0.104=0.825，ΔA測定=A測定-A空白=0.301-0.109=0.192，ΔA=ΔA標(biāo)準(zhǔn)-ΔA測定=0.825-0.192=0.633。按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

CAT酶活(U/g質(zhì)量)=10×（ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)）÷W×F=10×（0.633÷0.825）×400÷0.1=30690.91 U/g 質(zhì)量。
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