植物中酰脲含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC4375

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、提取液A液：自備無(wú)水乙醇；

2、試劑五：臨用前取1瓶加入2 mL蒸餾水溶解備用，可分裝后-20℃保存，-20℃保存一周；

3、試劑六：自備濃鹽酸；

4、標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg尿*素。臨用前加入632.5 μL蒸餾水配制成100 μmol/mL酰脲標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說(shuō)明：

選育高固氮活性豆科植物品種是提高豆科植物固氮能力的一個(gè)有效途徑。大豆根瘤菌固氮的最初輸出產(chǎn)物主要是酰脲（尿*素和尿囊酸）。酰脲是大豆一根瘤菌共生固氮中的氮代謝產(chǎn)物，是氮素貯藏和運(yùn)輸?shù)闹饕问剑诖蠖沟x中起著重要作用?？赏ㄟ^(guò)測(cè)定豆科植物組織中酰脲的含量，從而評(píng)估其固氮能力。

尿*素在過(guò)酸或堿條件下水解產(chǎn)生乙醛酸，然后在苯 肼和強(qiáng)酸條件下可被氧化，生成紅色絡(luò)合物，在535 nm處有特殊吸收峰，據(jù)此可由吸光值計(jì)算出樣本中酰脲的含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、鼓風(fēng)烘箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、30~50目篩、冰和蒸餾水、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

植物樣本：將供試的植物樣本在65℃的鼓風(fēng)烘箱中烘干，研磨成粉狀，過(guò)30~50目篩。按質(zhì)量（g）︰提取液體積（mL）1︰10~20比例（建議稱(chēng)取0.1 g烘干樣本，依次加入1.0 mL提取液A與1.0 mL提取液B，禁止將提取液A與提取液B混勻待用），漩渦混勻，在80℃水浴鍋中萃取5 min，然后3500 rpm，室溫，離心15 min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至535 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將試劑六與試劑七置于冰水浴中預(yù)冷30 min以上，并置于冰上待用。

3、 標(biāo)準(zhǔn)液的處理：將標(biāo)準(zhǔn)品配制成100 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)液后，用蒸餾水稀釋至25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125 nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

4、 操作表：（在1.5mL EP管中操作）

注意：對(duì)照管不進(jìn)行水浴加熱處理；尿囊酸測(cè)定管只需進(jìn)行第二次的沸水??；測(cè)定管、標(biāo)準(zhǔn)管及空白管在沸水浴加熱時(shí)，EP管蓋緊并用封口膜密封，避免液體蒸發(fā)影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

三、植物中酰脲含量計(jì)算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y= kx+b，將ΔA尿囊酸和ΔA酰脲分別帶入方程得到x₁（nmol/mL）和x₂（nmol/mL）。

2、 豆科植物中酰脲含量的計(jì)算：

尿囊酸含量（nmol/g 質(zhì)量）= x₁×V提取÷W==2×x₁÷W

酰脲含量（nmol/g 質(zhì)量）= x₂×V提取÷W=2×x₂÷W

V提?。杭尤胩崛∫后w積，2 mL；W：樣本質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)：

1、同一批檢測(cè)樣本需配1-2個(gè)空白管。

2、當(dāng)OD值高于1.5時(shí)，建議將樣本稀釋后檢測(cè)，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3、試劑六與試劑七在使用之前請(qǐng)先置于冰上預(yù)冷30 min以上。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、取0.1g馬齒莧，進(jìn)行樣本處理，按照測(cè)定步驟操作，使用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA酰脲=A酰脲測(cè)定管-A對(duì)照管=0.332-0.226=0.106，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0548x-0.024，計(jì)算x2=2.3723，按照計(jì)算公式計(jì)算：

酰脲含量（nmol/g 質(zhì)量）=2×x₂÷W=2×2.3723÷0.1=47.446 nmol/g 質(zhì)量。

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