蛋白質(zhì)總巰基含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

可見(jiàn)分光光度法

貨號(hào)：BC5800

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液配制：臨用前根據(jù)樣本量按照提取液一：提取液二=1mL：1 mL進(jìn)行配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，請(qǐng)勿一次性全部混合。

2、 若試劑二有析出，可置于37℃水浴加熱至澄清透明后使用。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：10mg還原型谷*甘肽（GSH）。臨用前加入1.3mL蒸餾水配制成25μmol/mL，2-8℃保存4周。

4、 0.125μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品配制：取50μL 25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品，加入950μL蒸餾水，充分混勻，配制成1.25μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品；然后取100μL 1.25μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品，加入900μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.125μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)品使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

巰基的存在使得蛋白質(zhì)能夠進(jìn)行二硫鍵的形成，從而維持分子的穩(wěn)定性和功能性。巰基還參與到氧化還原反應(yīng)中，具有重要的生物學(xué)作用。在細(xì)胞內(nèi)，巰基含量的變化與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，因此巰基也成為了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的重要研究對(duì)象。本試劑盒測(cè)定的是蛋白質(zhì)二硫鍵斷裂產(chǎn)生的巰基和本身游離巰基的總和。

還原劑會(huì)使二硫鍵裂解生成巰基，巰基會(huì)發(fā)生親核反應(yīng)，即巰基與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰，據(jù)此可以計(jì)算蛋白質(zhì)總巰基含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿、低溫離心機(jī)、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、丙酮（AR）、蒸餾水。

操作步驟

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（注：（1）植物葉片等纖維含量較高的樣本，溶解沉淀后4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),；（2）加入試劑一后會(huì)有大量氣泡產(chǎn)生，請(qǐng)緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬(wàn)細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔10秒，總時(shí)間3min）后，于4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（注：（1）若沉淀溶解不全，可4℃ 3000rpm離心3min，取上清作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；（2）加入試劑一后會(huì)有大量氣泡產(chǎn)生，請(qǐng)緩慢加入，建議使用5mL的EP管）。

3. 血清/血漿、牛奶等液體：取100μL液體樣本加入0.9mL丙酮，4℃，3000rpm 離心10min，棄上清。在沉淀中加入2mL試劑一，攪勻后溶解沉淀，沉淀溶解液作為樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。（注：若測(cè)定數(shù)值偏小，可改變樣本與丙酮的比例，如取0.2mL液體樣本加入0.8mL丙酮或0.3mL液體樣本加入0.7mL丙酮，注意同步修改計(jì)算公式）。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm。蒸餾水調(diào)零。

2、 操作表：（建議在5mL的EP管中操作）

三、蛋白質(zhì)總巰基含量的計(jì)算

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

蛋白質(zhì)總巰基含量（μmol/mg prot）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣本÷（V樣本×Cpr）×F

=0.125× ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×Cpr×F

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

蛋白質(zhì)總巰基含量（μmol/g 質(zhì)量）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷W×F

=0.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

3. 按照液體體積計(jì)算

蛋白質(zhì)總巰基含量（μmol/mL）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷V液樣×F =2.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

4. 按照細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計(jì)算：

蛋白質(zhì)總巰基含量（μmol/10⁶ cell）=ΔA測(cè)定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V試劑一÷N÷2×F=0.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.125μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.3mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測(cè)定，推薦使用BCA方法測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；V試劑一：提取時(shí)加入試劑一體積，2mL；V液樣：提取時(shí)加入的樣本體積，0.1mL；F：稀釋倍數(shù)；N：細(xì)胞/細(xì)菌總數(shù)，以10⁶計(jì)。

注意事項(xiàng)：

1. 若樣本ΔA測(cè)定<0.01，可適當(dāng)增大樣本量后測(cè)定，注意同步修改空白管和標(biāo)準(zhǔn)管及計(jì)算公式；若樣本ΔA測(cè)定>1.5，可用試劑一稀釋沉淀溶解液后測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式中的稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取100μL馬血清，按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.557-0.038=0.519，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.633-0.076=0.557，按樣本質(zhì)量計(jì)算蛋白質(zhì)總巰基含量得：

蛋白質(zhì)總巰基含量（μmol/mL）= 2.5×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)=2.329μmol/mL。

2、 取0.1036g鼠肝，按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.727-0.111=0.616，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.633-0.076=0.557，按樣本質(zhì)量計(jì)算蛋白質(zhì)總巰基含量得：

蛋白質(zhì)總巰基含量（μmol/g 質(zhì)量）= 0.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =2.669μmol/g 質(zhì)量。

3、 取0.1078g黃豆粉，沉淀溶解液用試劑一稀釋2倍后，按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=1.080-0.068=1.012，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.633-0.076=0.557，按樣本質(zhì)量計(jì)算蛋白質(zhì)總巰基含量得：

蛋白質(zhì)總巰基含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.25×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =8.427μmol/g 質(zhì)量。

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