尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UDPGT）活性檢測試劑盒說明書微量法

貨號：BC5815

規(guī)格：100T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑五：臨用前加入0.619mL蒸餾水，-20℃分裝可保存4周，避免反復凍融；

2. 工作液：臨用前根據樣本量按照試劑二：試劑三：試劑四=100μL：100μL：100μL（0.3mL，10T）的比例配制，現用現配；

3. 標準品：5μmol/mL的對硝 基苯*溶 液。臨用前取50μL 5μmol/mL對硝 基苯* 溶液，加入950μL蒸餾水，配制成0.25μmol/mL對硝 基苯*溶 液，現用現配。

產品說明：

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（glucuronosyltransferase，UDPGT/UGT，EC 2.4.1.17）是一種結合在內質網上的膜蛋白，該酶催化葡萄糖醛酸基團從供體尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（Uridine 5-Diphosphoglucuronic Acid，UDPGA）轉移至受體上，受體包括酚類、醇類、胺類和脂肪酸類。葡萄糖醛酸化代謝促進了藥物和其他外源物質通過腎臟或膽汁的排泄，在生物體內代謝、解毒、清除過程中發(fā)揮重要作用。

UDPGT催化供體尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的葡萄糖醛酸基團轉移至對硝 基苯 *，后者在405nm處有特征吸收峰，通過測定吸光值降低速率可計算UDPGT活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

稱取0.1g樣本，加入1.0 mL提取液，用勻漿器或研缽于冰上勻漿；

4℃，800g離心10 min，棄沉淀，留上清液，4℃，9000 g離心20 min，棄沉淀，留上清液；

4℃，12000g離心60 min，棄上清，留沉淀。沉淀中加入0.5 mL提取液重懸，置于冰上待測。

二、 測定步驟

1．可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至405nm，分光光度計蒸餾水調零；

2．將試劑一37℃預熱15min；

3．操作表（在EP管中加入下列試劑）：

三、UDPGT活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每min催化消耗1nmol對 硝基 苯*定義為一個酶活單位。

UDPGT活性（U/mg prot）=（ΔA測定÷ΔA標準×C標準）×V樣÷（Cpr×V樣）×10³÷T

=25×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

2. 按樣本質量計算

單位的定義：每g組織每min催化消耗1nmol對硝 基 苯*定義為一個酶活單位。

UDPGT活性（U/g 質量）=（ΔA測定÷ΔA標準×C標準）×V樣÷（W×V樣÷V樣總）×10³÷T

=12.5×ΔA測定÷ΔA標準÷W

C標準：0.25μmol/mL；V樣：反應體系中加入的樣本體積，0.05mL；V樣總：重懸沉淀加入提取液的體積，0.5mL；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；10³：單位換算系數，1μmol=10³nmol；T：反應時間，10min。

注意事項：

1. 如果?A測定小于0.004或測定管吸光值接近對照管，可以增加樣本量或者延長37℃反應時間后再進行測定；如果?A測定大于0.9，建議將重懸液用提取液適當稀釋后再進行測定。注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1. 取0.1027g新鮮小鼠肝臟樣本，加入1mL提取液進行冰浴勻漿，多次離心后加入0.5mL提取液重懸沉淀，按照

測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA測定=A對照-A測定=0.970-0.524=0.446，ΔA標準=A標準-A空白=0.533- 0.036=0.497，按樣本質量計算得：

UDPGT活性（U/g 質量）=12.5×ΔA測定÷ΔA標準÷W =109.224 U/g 質量

參考文獻：

[1] Visser TJ, Kaptein E, van Raaij JA. et al. Multiple UDP-glucuronyltransferases for the glucuronidation of thyroid hormone with preference for 3,3',5'-triiodothyronine (reverse T3) [J]. Federation of European Biochemical Societies Letters, 1993, 315(1): 65-68.

[2] Viollon-Abadie C, Lassere D, Debruyne E. et al. Ph eno , beta-naphthoflavone, clofibrate, and pregnenolone- 16alpha-carbonitrile do not affect hepatic thyroid hormone UDP-glucuronosyl transferase activity, and thyroid gland function in mice [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 1999, 155(1): 1-12.

[3] Nicod L, Rodriguez S, Letang JM. et al. Antioxidant status, lipid peroxidation, mixed function oxidase and UDP-glucuronyl transferase activities in livers from control and DOCA-salt hypertensive male Sprague Dawley rats [J]. Molecular and Cellular Biochemistry, 2000, 203(1-2): 33-39.

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