類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號(hào)：BC5665

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液：臨用前將粉劑一倒入提取液中，此溶液為懸濁液，使用前搖勻即可；

2、 試劑二工作液：：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：試劑二=171μL: 9μL（180μL，2T）的比例配制，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；

3、 試劑三 ：臨用前加入10 mL蒸餾水溶解，未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融；

4、 試劑六：試劑放于試劑瓶內(nèi)玻璃瓶中。臨用前加入6 mL蒸餾水，充分混勻，未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融；

5、 試劑七：試劑放于試劑瓶內(nèi)玻璃瓶中。臨用前加入6 mL蒸餾水溶解，未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融；

6、 工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：試劑四：試劑五：試劑六：試劑七=1.4mL：5μL：2μL：0.3 mL：0.3 mL（2007μL，約7T）的比例配制，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。（試劑四、試劑五使用需先將液體離心至底部使用）

產(chǎn)品說明：

類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycose flavonoid glycosyltransferase, UFGT）是莽草酸途徑的最后一個(gè)作用酶，也是使花色素形成穩(wěn)定的花色苷的第一個(gè)作用酶，并使其由無色轉(zhuǎn)為有色；UFGT是果實(shí)著色過程中的關(guān)鍵酶，它使不穩(wěn)定的花色素轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的花色苷。

UFGT催化UDPG與槲皮素生成UDP和槲皮素糖苷；UDP在丙 酮酸激酶與乳酸脫氫酶作用下，氧化NADH為NAD⁺，NAD⁺生成速度與UDP含量成正比，通過340nm吸光度下降速度反映UFGT活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），

進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，紫外分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表：首先在1.5mLEP管中按下表步驟加樣：

三、類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）活力計(jì)算

1、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每小時(shí)催化1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

UFGT活力(U/mg prot ) = ΔA×V反總II÷（ε×d）×10⁹÷ （Cpr ×V樣÷V反總I×V上清）÷T×F
= 4019.29×ΔA ÷Cpr×F

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：每g組織每小時(shí)催化1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

UFGT活力(U/g 質(zhì)量) = ΔA×V反總II÷（ε×d）×10⁹÷（W× V樣÷V樣總÷V反總I×V上清）÷T×F
 = 4019.29×ΔA÷W×F

V反總I：30℃第一步反應(yīng)體系總體積（V樣+V試劑二工作液+V試劑三），0.2mL；V反總II：37℃第二步反應(yīng)體系總體積，0.3×10^-3L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：石英比色皿或96孔板光徑，1cm；

V樣：加入樣本體積，0.02mL；V上清：第二步反應(yīng)中上清液體積，0.03 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，4h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；F：稀釋倍數(shù)；10⁹：換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

注意事項(xiàng)：

1、 如果A1測定＜A1空白或者ΔA大于0.5，，可以對上清液進(jìn)行稀釋或者縮短30℃反應(yīng)時(shí)間重新測定；?A＜0.005，可以加大樣本量或者延長30℃反應(yīng)時(shí)間重新測定。最終計(jì)算時(shí)同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取0.1078g洋桔梗，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計(jì)算A測定=A1測定-A2測定=0.9988-0.9807=0.0181，A空白=A1空白-A2空白=0.8157-0.8121=0.0036，?A =A測定-A空白= 0.0145。帶入公式計(jì)算：

UFGT活力(U/g 質(zhì)量)= 4019.29×ΔA÷W= 540.63 U/g 質(zhì)量

2、 稱取0.1133g洋蔥，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用微量石英比色皿測得計(jì)算A測定=A1測定-A2測定=0.8309-0.8157=0.0152，A空白=A1空白-A2空白=0.8157-0.8121=0.0036，?A =A測定-A空白=0.0116。帶入公式計(jì)算：

UFGT活力(U/g 質(zhì)量)= 4019.29×ΔA÷W=411.51 U/g 質(zhì)量

參考文獻(xiàn)：

[1] Parvaneh, TaherehAbedi, BahramDavarynejad, Gholam HosseinMoghadam, Ebrahim Ganji. Enzyme activity, phenolic and flavonoid compounds in leaves of Iranian red flesh apple culti vars grown on different rootstocks[J]. Scientia horticulturae, 2019, 246.

[2] Mori K, Sugaya S, Gemma H. Decreased anthocyanin biosynthesis in grape berries grown under elevated night temperature condition[J]. Hort, 2005, 105(3):319-330. 

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