吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5385

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液二：易揮發(fā)試劑，用完及時(shí)擰蓋封口放回-20℃。

2、 提取液的配制：根據(jù)樣本量按提取液一：提取液二=0.99mL：0.01mL（1T）的比例配制提取液，現(xiàn)用現(xiàn)配，禁止提前配制。

3、 試劑三：臨用前取一支試劑三加入5.6mL試劑一，充分混勻。未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融。

4、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入 1.4 mL 蒸餾水，即 2 µmol/mL NADH標(biāo)準(zhǔn)液。未用完的試劑分裝保存，-20℃可以保存2周，避免反復(fù)凍融。臨用前取100μL的2 µmol/mL NADH標(biāo)準(zhǔn)液于EP管中，加入700μL蒸餾水充分溶解，配制成0.25μmol/mL的NADH標(biāo)準(zhǔn)液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說(shuō)明：

吡咯啉-5-羧酸還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)是廣泛存在于原核和真核生物中的一種重要的管家蛋白。在NAD(P)H的作用下，吡咯啉-5-羧酸(P5C)在吡咯啉-5-羧酸還原酶作用下轉(zhuǎn)化為脯*酸，并且P5CR 還被發(fā)現(xiàn)能夠在大腸桿菌中參與到硫代脯*酸 (Thioproline) 的代謝過(guò)程。

硫代脯*酸在吡咯啉-5-羧酸還原酶催化作用下脫氫，并伴隨著NAD轉(zhuǎn)化為NADH。在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH 反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）等液體：直接測(cè)定。(若溶液呈現(xiàn)渾濁，則離心取上清后再測(cè)定)。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至450nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、操作表：

充分混勻，37℃反應(yīng)顯色30min，取200μL于微量玻璃比色皿或96孔板中，測(cè)定在450nm處的吸光度。記作A_測(cè)定，A_對(duì)照，A_{標(biāo)準(zhǔn)}，A_空白。ΔA_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照，ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_空白。（標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只需做1-2次。）

三、P5CR活性計(jì)算

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

P5CR活性（U/mg prot）=(ΔA_測(cè)定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣÷（Cpr×V_樣）÷T×10³×F=8.333×ΔA_測(cè)定÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}÷Cpr×F

(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

P5CR活性（U/g 質(zhì)量）= (ΔA_測(cè)定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣÷（W÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=8.333×ΔA_測(cè)定÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)目計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

P5CR活性（U/10⁴ cell）= (ΔA_測(cè)定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣÷（500÷V_樣總×V_樣）÷T×10³×F=0.0167×ΔA_測(cè)定÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}×F

(4) 按血清（漿）等液體體積計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）等液體每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

P5CR活性（U/mL）= (ΔA_測(cè)定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}) ×V_樣÷V_樣÷T×10³×F=8.333×ΔA_測(cè)定÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}×F

C_{標(biāo)準(zhǔn)}: NADH標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，0.25μmol/mL；V_樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.02mL；V_樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)目，500萬(wàn)；10³：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1μmol/mL=10³nmol/mL；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. 如果A_測(cè)定大于1.8或者?A_測(cè)定大于1，可以減少樣品量或者縮短反應(yīng)時(shí)間；若?A_測(cè)定小于0.01，可以加大樣品量或者延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至1h或者更長(zhǎng)時(shí)間。計(jì)算公式注意同步修改

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取0.0993g橙子葉，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照=0.318-0.288=0.03，ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_空白=0.538-0.181=0.357，帶入公式計(jì)算：

P5CR活性(U/g 質(zhì)量)= 8.333×ΔA_測(cè)定÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =8.333×0.03÷0.357÷0.0993=7.052 U/g 質(zhì)量

2、 稱取0.1006g小鼠腎臟組織，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照=0.369-0.274=0.095，ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_空白=0.538-0.181=0.357，帶入公式計(jì)算：

P5CR活性(U/g 質(zhì)量)= 8.333×ΔA_測(cè)定÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =8.333×0.095÷0.357÷1.006=22.042 U/g 質(zhì)量

3、 吸取0.02mL羊血清，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算ΔA_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照=0.299-0.146=0.153，ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_空白=0.538-0.181=0.357，帶入公式計(jì)算： 

P5CR活性(U/mL)= 8.333×ΔA_測(cè)定÷ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F =8.333×0.153÷0.357=3.571 U/mL

參考文獻(xiàn)：

FENG Chang-Z, XIE Y H, CAO Y, et al. Expression, Purification and Physicochemical Characteristics of Pyrroline-5-Carboxylic Acid Reductase in Drosophila[J]. Chinese Journal of Biological Engineering, 2012, 32(6):8. 

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