多胺氧化酶（PAO）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5225

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制： 

1、 工作液：臨用前根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需量按照試劑一：試劑二：試劑三=600μL：60μL：60μL（約5T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說(shuō)明：

多胺氧化酶（Polyamine Oxidases，PAO）是催化生物體內(nèi)多胺氧化的關(guān)鍵酶，多胺能夠與核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜分子互作，直接影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡，而PAO可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多胺水平和生成物的濃度，參與各種植物體對(duì)逆境脅迫的反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

PAO催化多胺氧化生成H₂O₂，過(guò)氧化物酶在有氧存在時(shí)催化H₂O₂分解，同時(shí)將鄰聯(lián)茴香胺氧化生成有色物質(zhì)，在500nm處有特征吸收峰，顏色深淺與PAO活性成線(xiàn)性關(guān)系。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式低溫離心機(jī)、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本的處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積（mL）為1︰5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。于4℃，10000g離心10min，取上清，置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)胞或細(xì)菌：按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量（10⁴個(gè)）︰提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率200W，超聲3s，間隔7s，總時(shí)間3min），于4℃，10000g離心10min，取上清，置于冰上待測(cè)。

3. 液體：直接測(cè)定。若有沉淀，離心后測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至500nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 測(cè)定前將工作液置于37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱預(yù)熱10min以上。

3、操作表：在96孔板或EP管中分別加入下列試劑：

三、計(jì)算公式

A. 按96孔板計(jì)算：

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：在每毫升反應(yīng)體系中，每毫克蛋白每分鐘催化在500nm處吸光值增加0.0005定義為一個(gè)酶活力單位。

PAO活性（U/mg prot）＝ΔA×V反÷（V樣×Cpr）÷T÷0.0005×F=133.33×ΔA÷Cpr×F

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：在每毫升反應(yīng)體系中，每克組織每分鐘催化在500nm處吸光值增加0.0005定義為一個(gè)酶活力單位。

PAO活性（U/g 質(zhì)量）＝ΔA×V反÷（W÷V提×V樣）÷T÷0.0005×F=133.33×ΔA÷W×F

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：在每毫升反應(yīng)體系中，每10⁴ 個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘催化在500nm處吸光值增加0.0005定義為一個(gè)酶活力單位。

PAO活性（U/10⁴ cell）＝ΔA×V反÷（500÷V提×V樣）÷T÷0.0005×F=0.2666×ΔA×F

4. 按液體體積計(jì)算

酶活單位定義：在每毫升反應(yīng)體系中，每毫升液體樣本每分鐘催化在500nm處吸光值增加0.0005定義為一個(gè)酶活力單位。

PAO活性（U/mL）＝ΔA×V反÷V樣÷T÷0.0005×F=133.33×ΔA×F

V反：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入樣本上清體積，0.05mL；V提：加入提取液的體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量，500萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，60min；F：稀釋倍數(shù)。

B. 按比色皿計(jì)算：

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：在每毫升反應(yīng)體系中，每毫克蛋白每分鐘催化在500nm處吸光值增加0.001定義為一個(gè)酶活力單位。

PAO活性（U/mg prot）=ΔA×V反÷（V樣×Cpr）÷T÷0.001×F=66.67×ΔA÷Cpr×F

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：在每毫升反應(yīng)體系中，每克組織每分鐘催化在500nm處吸光值增加0.001定義為一個(gè)酶活力單位。

PAO活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA×V反÷（W÷V提×V樣）÷T÷0.001×F=66.67×ΔA÷W×F

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：在每毫升反應(yīng)體系中，每10⁴ 個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘催化在500nm處吸光值增加0.001定義為一個(gè)酶活力單位。

PAO活性（U/10⁴ cell）=ΔA×V反÷（500÷V提×V樣）÷T÷0.001×F=0.133×ΔA×F

4. 按液體體積計(jì)算

酶活單位定義：在每毫升反應(yīng)體系中，每毫升液體樣本每分鐘催化在500nm處吸光值增加0.001定義為一個(gè)酶活力單位。

PAO活性（U/mL）=ΔA×V反÷V樣÷T÷0.001×F=66.67×ΔA×F

V反：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入樣本上清體積，0.05mL；V提：加入提取液的體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量，500萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，60min；F：稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱(chēng)取0.1023g珍珠梅葉片加入1mL提取液進(jìn)行樣本處理，離心取上清后按測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得A1=0.197，A2=0.382，ΔA=A2-A1=0.185，根據(jù)計(jì)算公式得：

PAO活性（U/g 質(zhì)量）=133.33×ΔA÷W=133.33×0.185÷0.1023=241.115 U/g 質(zhì)量

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