海藻糖合成酶（TS）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。

貨號(hào)：BC4955

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一瓶先加入6mL蒸餾水，震蕩使其充分溶解（若溶解后的試劑中有黑色顆粒物，可離心后取上清使用），用不完的試劑2-8℃保存2周。

2、 工作液的配制：臨用前將試劑三和試劑四1:1等體積混合，根據(jù)樣本實(shí)際所需用量現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1 mL蒸餾水配制成50 μmol/mL的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用不完的試劑2-8℃保存2周。然后用蒸餾水八倍稀釋成6.25 μmol/mL的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（建議吸取25 μL 50μmol/mL麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入175 μL蒸餾水中，充分混勻）待測(cè)，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說(shuō)明：

海藻糖是功能性低聚糖，具有非還原性、保濕性、熱酸穩(wěn)定性、抗凍結(jié)性等特性，是細(xì)胞在不良環(huán)境條件下產(chǎn)生的一種重要的抗逆應(yīng)激物之一，它對(duì)生物大分子和生物組織有著非特異性的保護(hù)作用。

海藻糖合成酶（Trehalose Synthase，TS）能催化麥芽糖生成海藻糖，是海藻糖生物合成的關(guān)鍵途徑之一。本試劑盒使用糖化酶分解剩余麥芽糖為葡萄糖，通過(guò)葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖含量，按照麥芽糖減少的量表示海藻糖合成酶的活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、

蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1 mL提取液，超聲波破碎細(xì)胞（功率200W，超聲3s，間隔9s，重復(fù)30次）；然后8000 g，4℃，離心10 min，取上清（若上清不夠澄清，建議重復(fù)上述離心步驟），置于冰上待檢。

組織：按照組織質(zhì)量（g）: 提取液體積（mL）為1 : 5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1 g組織，加入1 mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000 g，4℃，離心10 min，取上清（若上清不夠澄清，建議重復(fù)上述離心步驟，置于冰上待檢。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 操作表：

（1）酶促反應(yīng)（在EP管中進(jìn)行以下操作）：

（2）顯色反應(yīng)（在EP管或96孔板中進(jìn)行以下操作）

注：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)1~2次。

三、酶活性計(jì)算

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1 nmol 麥芽糖生成1 nmol 海藻糖定義為一個(gè)酶活力單位。

TS酶活（U/mg prot）= C標(biāo)×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣÷（V樣×Cpr）÷T×F×1000÷2

=26.041×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr×F

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化1 nmol 麥芽糖生成1 nmol 海藻糖定義為一個(gè)酶活力單位。

TS酶活（U/g 質(zhì)量）= C標(biāo)×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣÷（V樣÷V樣總×W）÷T×F×1000÷2

=26.041×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

3、按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

單位的定義：每10⁴個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1 nmol 麥芽糖生成1 nmol 海藻糖定義為一個(gè)酶活力單位。

TS酶活（U/10⁴ cell）= C標(biāo)×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣÷（V樣÷V樣總×cell）÷T×F×1000÷2

=26.041×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷cell×F

C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，6.25 μmol/mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，120 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；cell：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，以萬(wàn)計(jì)；F：稀釋倍數(shù)；1000：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1 μmol=1000 nmol；2：1分子麥芽糖可轉(zhuǎn)化為2分子葡萄糖。

注意事項(xiàng)：

1、 當(dāng)吸光值大于1.5或者ΔA測(cè)定大于1時(shí)，建議將樣本稀釋后測(cè)量。計(jì)算公式注意乘以稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1 g小鼠肝臟加入1 mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清用蒸餾水稀釋2倍后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)定后計(jì)算ΔA測(cè)定=A對(duì)照-A測(cè)定=1.177-0.536=0.641、ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=1.031-0.049=0.982，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

TS酶活（U/g 質(zhì)量）= 26.041×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F=339.965 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1 g海帶加入1 mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)定后計(jì)算ΔA測(cè)定=A對(duì)照-A測(cè)定=1.366-0.793=0.573、ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=1.031-0.049=0.982，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

TS酶活（U/g質(zhì)量）= 26.041×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F=151.950 U/g 質(zhì)量。

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